James Best nació como Jewel Franklin Guy el 26 de julio de 1926, en Powderly, Kentucky, Estados Unidos. Sus padres feuron Lark y Lena Guy. Su madre era la hermana de Ike Everly, el padre del dúo pop The Everly Brothers. Después de que su madre muriera de tuberculosis en 1929, James, de tres años de edad, fue enviado a vivir en un orfanato. Más tarde fue adoptado por Armen Best (1897-1984) y su esposa Essa (1896-1988) y fue a vivir con ellos en Corydon, Indiana. Sirvió en el Ejército de los Estados Unidos en la Segunda Guerra Mundial, recibiendo instrucción en 1944 en Biloxi, Mississippi como artillero de bombardero B-17, pero cuando terminó la instrucción la guerra estaba a punto de acabar y entró en la Policía Militar. Best desempeñó un papel importante en la estabilización de Alemania, destruida por la guerra tras su rendición. Mientras estaba en Alemania, Best se trasladó de la Policía Militar a una unidad de servicios especiales de actores para el ejército estadounidense que viajó por Europa realizando obras de teatro para las tropas. Este fue el verdadero comienzo de su carrera como actor.

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